成功案例转录组测序助力成纤维细胞生成
年5月，中山大学中山眼科中心眼科学国家重点实验室向孟清和晋康新课题组医院眼科中心沈吟课题组，于SciAdv杂志在线发表了题为"Generationofself-organizedsensoryganglionorganoidsandretinalganglioncellsfromfibroblasts"的研究成果，其中转录组测序部分由百迈客协助完成。
本研究通过对多个SG和RGC转录因子TF的筛选，作者确定了三个TF组合ABI是重编程小鼠和人类成纤维细胞为自组织和网络化iSG类器官的最有效组合。通过免疫染色、qRT-PCR、全细胞膜片钳记录、钙成像以及混合bulk转录组和单细胞转录组scRNA-seq方法，能够证明iSG类器官具有分子和细胞特征、亚型多样性、电生理特性和周围神经支配能力和周围SG的特征模式。此外，使用免疫标记和scRNA-seq分析，鉴定出了真正的RGC特异性分子标记，以证明ABI组合具有从成纤维细胞诱导少量iRGC的额外能力。不同于内源性SG的ABI重编程的iSG类动物器官，iRGC保持类似于视网膜中内源性RGC的分散分布模式。
研究背景
神经节是在周围神经系统（PNS）或中枢神经系统（CNS）中发现的一簇或一组神经细胞。它们通常相互连接，并与PNS和CNS中的其他结构相互连接，以形成复杂的神经网络。体感神经节SG中的多种神经元类型（例如背根神经节DRG）专门用于感觉不同的感觉状态，例如本体感受、机械感受，痛觉（即疼痛知觉）、热感受和瘙痒（即痒知觉）。类似地，视网膜神经节细胞RGC有许多亚型，专门用于从视网膜向大脑中的中央视觉系统传输不同的视觉信息（例如颜色、对比度和运动方向）。
尽管形态和胚胎起源有所不同，但体感和视网膜神经节在基因表达上有广泛的重叠，并且作者在20多年前提出了两者都可能共享遗传调控网络的建议。通过特定的TF将体细胞重编程为感觉神经元，为研究SG发育和感觉疾病发病机理以及产生用于患者特异性细胞替代治疗的细胞、药物筛选和体外疾病建模提供了强有力的策略。Brn3a和Ngn1或Ngn2或包括TF1，Ascl1，Ngn1，Isl2，Myt11和Klf7在内的5种转录因子TF可以直接从鼠和人成纤维细胞中诱导伤害性感受器和其他亚型的感觉神经元，但尚未重编程为SG类器官，并且尚不清楚RGS是否由这些TF的组合诱导而来。
鉴于类器官的优势，在研究发育机制以及对相关疾病进行建模和治疗方面，作者试图使用可控制体内感觉和视网膜神经节发育的TF从小鼠和人成纤维细胞中生成神经节类器官和视网膜神经节细胞RGC。SG神经元和RGC之间广泛的分子同源性在如何区分这两种类型的神经元方面造成了难题，需要筛选RGC特异性标记，需要筛选诱导成纤维细胞自组织和网络化的iSG(inducedSG)和iRGC(inducedRGCs)的最有效方法。
研究方法
多种转录因子共转染进行小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）重编程实验，筛选相关转录因子TF组合；
qPCR/WB/免疫荧光染色观测相关基因或蛋白表达或重编程结果；
长期延时显微镜追踪ABI重编程的神经元组织成iSG的方式；
EdU细胞增殖实验确定重编程过程是否涉及中间增殖性祖细胞状态；
ABI诱导的iSG冷冻切片进行了免疫染色分析是否同一iSG中包含不同类型的感觉神经元；
电生理实验：全细胞膜片技术来检测诱导的神经元兴奋性及其放电活动；钙成像技术检测诱导的iSG损伤感觉神经元的离子通道特征/神经元活动；
对ABI和GFP转染的MEF进行bulkRNA测序分析揭示ABI重编程后的iSG分子水平改变：GSEA富集到的GOterm以及SG和视网膜神经节基因表达上下调分析
分离了ABI诱导的iSG，以及小鼠DRG、RGC单细胞悬液进行单细胞转录组测序分析scRNA-seq，进一步表征iSG神经元和iRGC，鉴定真正的RGC特异性分子标记。
研究结果
1、筛选将成纤维细胞重编程为iSG类器官的TF
先前的研究表明，SG和RGC具有相似的转录调控机制，例如Brn3TF（Brn3a和Brn3b）和Isl1参与DRG神经元和RGC的规范和分化。Ascl1已显示在体细胞诱导性神经元（iN）重编程中起重要作用。第一步，作者试图通过测试Ascl1与22种SG和视网膜TF的组合来检测小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）诱导为SG神经元和RGC效果（Brn3b、Isl1、Math5、Ebf1、Pax6、Tfap2a、Nr4a2、Nrl、Crx、Ptf1a、Neurod1、Lhx2、Ngn1、Ngn2、Chx10、Sox2、Rx、Meis1、Foxn4、Otx2、Sox9和Six3）。当MEF被强力霉素（Dox）诱导的Ascl1和Brn3b（AB）或Isl1（AI）慢病毒感染，并在含有Dox的神经分化培养基中培养时，它们在第7天开始改变形态并在第14天开始形成可见的神经元簇（图1，C和D）。当Ascl1单独使用或与其余20个TF结合使用时，不会发生这种现象（图1B）。当MEF同时感染Brn3b和Isl1病毒或仅感染绿色荧光蛋白（GFP）病毒时，都不会发生这种情况（图1，A和E）。当将Ascl1与Brn3b和Isl1（ABI）结合使用时，它们再次诱导了MEF的形态变化，但更重要的是，与Brn3b（AB）或Isl1（AI）双因素组合相比，它们明显诱导了更多的神经元簇（图1，C，D，F和N），表明Brn3b和Isl1在将MEF重新编程为神经元簇中具有协同作用。
由双因子或三因子组合（AB，AI和ABI）诱导的神经元团簇似乎由厚的束状神经纤维相互连接，并且在形态上类似于SG神经丛（图1，G-I），因此被命名为iSG类器官。iSG神经元和相关的神经纤维对神经元标记Tuj1具有高度免疫反应性（图1，J和K）。Tuj1免疫标记法还显示，AI和ABI诱导的神经元主要形成iSG，只有少数散布在iSG之外（图1，J，K和P）。单独的Ascl1诱导的神经元大多数具有不成熟的形态，而BAM（Brn2，Ascl1和Mytl1）的组合诱导成熟的神经元散乱而不是成簇（图1，L，M和P）。因此，作者确定了能够诱导MEF分化为iSG的AB，AI和ABITF组合，其中最有效的是ABI三因子组合。
图1，上下滑动查看图片
为了研究将ABI重编程的神经元组织成iSG的方式，作者使用了长期延时显微镜在培养过程中追踪它们。为此，从CAG-GFP转基因小鼠胚胎中制备MEF，并在延时记录前由ABI诱导10天。与MEF相比，重新编程的单个神经元看起来更圆且带有神经突，并显示出更高的对比度和更亮的GFP荧光（图1O）。在几十个小时的时间里，它们首先通过迁移形成了较小的细胞簇，然后聚集成了越来越大的类似于SG的簇。未观察到Ascl1诱导的神经元的这种自组织现象。
来自MEF的TF诱导iSG可能是通过直接细胞转化或可能是通过中间增殖性祖细胞介导的。为了区分这些可能性，在用AI或ABI重新编程的第14天用5-乙炔基2-脱氧尿苷（EdU）脉冲标记细胞24小时，发现几乎没有神经元标记Tuj1阳性细胞被EdU标记，而大约15％的Tuj1阴性细胞（例如MEF）被标记。然后，从重编程的第一天开始，在EdU存在下用ABI对MEF进行了13天的重编程，只有6.1％的Tuj1阳性细胞被EdU标记，而73.1％的Tuj1阴性细胞被标记，这表明iSGs很可能是直接细胞转分化诱导而未经历增殖性中间状态。与这些结果一致，通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析确定，在ABI重编程整个时间过程（从第1天到第12天）中均未检测到神经祖细胞标记基因Nestin和Olig2的表达水平增加。同样，在ABI重编程的过程中，也未诱导多能因子基因Oct4、Klf4和Nanog的表达。此外，免疫染色显示从ABI重编程的第1天到第12天，神经祖细胞标记物Nestin，多能祖细胞标记Nanog和Oct4或Sox2（神经和多能祖细胞两者的标记物）均未见蛋白表达。因此，iSG最有可能直接细胞转分化诱导形成，而没有经历神经或多能祖细胞的中间状态。
考虑到Brn3a和Brn3b之间的功能冗余以及相似的DNA结合和转录特性，研究了这2个因子在体细胞重编程中是否可互换。测试了在将MEF重编程为iSG时Brn3a是否能够替代Brn3b，并发现确实可替代（图1N）。
2、iSG神经元表现出周围感觉神经元的分子特征
通过免疫荧光染色和qRT-PCR分析，我们检查了多种分子神经元标志物，包括一般的和细胞类型特异性的，以表征通过ABI从MEF重新编程的iSG（Ascl1+Brn3b+Isl1或Ascl1+Brn3a+Isl1），发现iSG对Tuj1和Map2具有高度免疫反应性（图2，A和O），这是2个普遍的神经元标志，还表达了突触蛋白和Vamp（突触素）（图2，B和C），表明网络化的iSG神经元能够形成突触并释放突触小泡。在正常SG中，高分子量神经丝蛋白NF和中间神经丝周围蛋白分别在A纤维和C纤维神经元中表达，并且都在iSG中表达（图2，D，E和P）。iSG中的许多神经元对囊泡谷氨酸转运蛋白1和2（vGLUT1和vGLUT2）也具有免疫反应性（图2，F和G），这与周围感觉神经元主要是兴奋性谷氨酸能神经元这一事实相一致。如qRT-PCR所确定，与被GFP慢病毒感染的MEF相比，ABI诱导的iSG中Tuj1、Map2、NF、vGlut1、vGlut2和vGlut3基因的表达明显上调证实了这些免疫标记结果（图2W）。
在DRG中，神经营养蛋白受体表达标志着感觉神经元的亚型。例如，TrkA由皮肤伤害性和热感受性神经元表达，TrkB由一部分皮肤机械感受性神经元表达，而TrkC由本体感受性神经元表达。在通过ABI重新编程的iSG中，qRT-PCR分析显示TrkA、TrkB和TrkC基因表达显著上调（图2W）。此外，免疫标记证实了诱导的神经节神经元本体和神经纤维中都存在TrkA、TrkB和TrkC蛋白（图2，H至J）。每种Trk受体在大约30％的诱导性神经元iN中，所有三个Trk受体来标记了87％的iN（图2Y），这表明每种Trk受体在诱导性神经节神经元的不同亚群中表达。c-Ret和TH分别在非肽能感受器和C-低阈值机械感受器的亚群中表达，观察到了iSG和相关神经纤维中2种蛋白的表达（图2，K和L）。此外，在iSG神经元中也发现了泛感觉神经元标记物Brn3a（对于由Ascl1+Brn3b+Isl1诱导的iSG）和神经生长因子（NGF）受体p75NTR（图2，M和N）。qRT-PCR验证了iSG中Brn3a和p75NTR表达的上调，并另外揭示了CGRP的上调，CGRP是肽能损伤感觉神经元亚群的标志物（图2W）。
图2通过qRT-PCR分析进一步鉴定了iSG中TrkA阳性损伤感觉神经元。在iSG中，受体离子通道基因Trpv1/2/3和Trpa1（感知热和冷）的表达显著上调（图2X），还存在P2X3、Bdkrb1和Accn1/2的表达，它们是负责损伤感测的受体基因（图2X）。此外，还观察到其他疼痛感知途径基因的诱导表达，包括钠通道基因Scn11a、钾通道基因Kcnq2、钙通道基因Cacna1a和Cacna2d1以及神经递质受体基因Gria1和Nk1r（图2X）。为了进一步研究在同一iSG中是否将不同类型的感觉神经元聚集在一起，对ABI诱导的iSG冷冻切片进行了免疫染色分析。除了在同一iSG中对Tuj1和Brn3a之间进行共标记外，还发现在同一iSG中共存在外周蛋白+和HuC/D+神经元，P2X3+和vGLUT2+神经元以及TrkA+和TrkB+神经元（图2，Q至T）。此外，在同一个iSG中检测到TrkA、P2X3和NF共表达，TrkA、外周蛋白和HuC/D等3种标记物的共表达（图2，U和V），表明单个iSG可能是不同的iSG感觉神经元类型的集合。
在ABI重编程过程中，qRT-PCR分析显示，从第3天开始逐步诱导常规神经元标记基因Tuj1和Map2的表达，而直到第3天至第6-9天才诱导其他感觉神经元标记基因，包括Trpv2、TrkC和Brn3a。与此相符的是，直到第6天，Brn3a免疫反应性细胞才出现，且大部分为散布型，但到第9或12天时，它们大多融合为iSG。在ABI重新编程过程中，感觉神经元标记的诱导稍晚于一般神经元标记。神经元被诱导的同时，成纤维细胞标记基因Col1a1和Twist2从第3天开始逐渐下调。
AI或AB诱导的iSG免疫染色表明，它们还包含表达典型感觉神经元标记Tuj1、Map2、Dcx（双皮质素）、突触蛋白、NF、外周蛋白、vGLUT1、TrkA、TH、HuC/D和Brn3a的神经元，表明，某些TF组合（ABI，AI和AB）能够将MEF重编程为包含本体感受性、机械感受性、损伤感受性和热感受性感觉神经元的iSG。
3、iSG表现出成熟的感觉神经元生理特征
为了评估通过ABI或AI从MEF重编程的iSG内外的神经元电生理特性，对具有神经元形态的细胞进行了全细胞膜片钳记录（图3A）。诱导9天后，记录的神经元产生钾电流和小的钠电流，但没有动作电位，表明它们在功能上不成熟。在第2周，绝大多数神经元（37个中的34个）具有典型的钠和钾电流，并表现出动作电位响应（图3，B至F）。其中，大多数（70.3％）是多峰神经元，其余（21.6％）是单峰神经元（图3，B，C，E和K），类似于通过Brn3a和Ngn1或Ngn2诱导人成纤维细胞重编程的神经元。内向钠电流可以被河豚毒素（TTX）特异性阻断，并可以通过去除而恢复（图3，H至J）。此外，与突触蛋白的免疫反应性一致（图2B），一些神经元（37个中的2个）表现出自发的突触后电流（图3G），表明在iNs之间形成了功能性突触。因此，由ABI或AI诱导的iSG神经元具有成熟神经元的膜和生理特性。
图3，上下滑动查看图片
损伤感觉神经元表达离子通道Trpv1、Trpm8和Trpa1，分别响应热、冷和有毒化学物质。通过钙成像，对Trpv1和Trpm8使用了特定的激动剂辣椒素（10μM）和薄荷醇（μM），以确认这2个通道在iSG神经元中的功能表达。瞬时灌注KCl（mM）以监测记录开始和结束时细胞的功能活力。仅选择显示出对KCl响应的细胞进行分析。与钙指示剂Fluo-8AM孵育后，几乎所有由ABI诱导的iSG簇均显示绿色荧光（图3，L至N）。在所有记录的细胞中，有56.8％（44个中的25个）对辣椒素有反应，而70.4％（27个中的19个）对薄荷醇有反应（图3，从O到U），表明大量iSG神经元表达损伤感觉神经元的离子通道特征。4、iSG神经元的整合和神经支配特性
通过从成年大鼠DRG外植体中微注射从CAG-GFP小鼠胚胎重编程的解离的iSG神经元，研究了iSG神经元在DRG中生存和整合的能力。移植外植体培养2周后，发现GFP+iSG神经元存活、扩散并整合在DRG中，并且对泛感觉神经元标记HuC/D具有免疫反应性。此外，它们中的很大一部分对TrkA具有免疫反应性，而一小部分表达TrkB或TrkC，表明iSG神经元在DRG中保持亚型特异性。
与它们的感觉神经元身份一致，在培养一周后，iSG神经元从Tau-GFP小鼠胚胎中重编程，并与罗丹明标记的感觉神经元自发聚集，这些神经元从E13.5小鼠DRG上解离，形成由神经纤维互连的DRG样类器官。相反，当GFP+iSG神经元与P0小鼠皮肤细胞共培养时，它们并未与皮肤细胞共聚集，它们投射到具有多个末端神经末梢的波形蛋白免疫反应性表皮细胞并对其进行神经支配，这与DRG神经元通常支配其表皮中的周围靶标这一事实一致。
5、鉴定RGC标志基因
周围SG神经元和RGC具有许多共同的分子标记，因此难以在细胞培养中区分这两种类型感觉神经元。Brn3a、Brn3b和Isl1是对视网膜细胞发育，尤其是RGC发育至关重要的TF，所以它们也可能能够将MEF重新编程为RGC。因此，需要确定可以明确区分来自外周感觉神经元的RGC的分子标记。假设这样的唯一标记可以是单分子标记或多分子标记的组合，这些标记必须仅存在于视网膜内的RGC中，而不能出现在外周感觉神经元或任何其他组织中。
在哺乳动物的视网膜中，早期研究已将Brn3a和Brn3b确定为RGC的金标准标记，但同时它们在周围SG和其他CNS区域中的表达。在小鼠中，视网膜和DRG切片的免疫标记证实了Brn3a和Brn3b在视网膜内RGC中的特异性以及它们在DRG神经元中的广泛表达，表明仅Brn3a和Brn3b不能将RGC与外周DRG神经元区分开。同样，许多其他常用的RGC标记，包括Thy1.2，RPF-1，Rbpms，HuC/D，Six6，Ebf，Isl1，Zeb2，Lmo4，Ldb1和Sncg，均在DRG中显示表达。在RGC和DRG中都表达了许多感觉神经元标记，包括CGRP，外周蛋白，vGLUT2，vGLUT3，GABA，TrkA，TrkB，TrkC和P2X3。Pax6似乎是所有测试标记中唯一的例外，它在RGC和视网膜内核层中表达，但在DRG中不存在。如果仅在视网膜内的RGC中表达Brn3a，Brn3b，Thy1.2，RPF-1和Rbpms，则Pax6与这些蛋白中的任何一种的组合都可以作为RGC的潜在唯一标识符。
通过其他CNS区域的免疫标记测试了双阳性标记物的独特性。双重免疫染色显示，尽管DRG缺失，但对Pax6和RPF-1，Thy1.2，Rbpms，HuC/D或Tuj1具有免疫反应性的神经元细胞不仅存在于视网膜中，而且还存在于脊髓中（图4A），排除了它们作为特异RGC标记的用途。Isl1+Pax6+双阳性细胞不存在于DRG和脊髓中，但同时存在于视网膜的神经节细胞层和内核层中（图4A），也排除了这种组合作为特定的RGC标识符。相比之下，Brn3a+Pax6+和Brn3b+Pax6+双阳性细胞仅是视网膜中的RGC，而在DRG或脊髓中则未发现（图4A）。鉴于在中脑和小脑中检测到Brn3a/Brn3b表达，调查了在这两个脑区域中是否存在Brn3a+Pax6+和Brn3b+Pax6+双阳性细胞，在E13.5，P4和P21期均未发现（图4A）。因此，这些结果共同证明Pax6和Brn3a或Brn3b双标记的组合可以用作RGC的特定标识符。
图4A使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术来进一步确认Brn3a+Pax6+和Brn3b+Pax6+双阳性标记的特异性。Brn3b-GFP敲入小鼠系中富集RGC进行单细胞转录组测序。此外，分离了成年小鼠DRG细胞，然后对其进行了相似的测序。大多数DRGs表达Pax6，Brn3a或Brn3b以及Pax6和Brn3a或Brn3b。特别是，绝大多数RGC对Pax6和Brn3a都是阳性的。相比之下，尽管大多数DRG细胞中都存在Brn3a和Brn3b，但完全没有表达Pax6和Brn3a或Brn3b的DRG细胞，这与Pax6和Brn3a或Brn3b双重标记组合的想法一致可用于区分RGC和DRG细胞。
6、iRGC表征
为了评估除iSG之外，ABI和AI是否能够诱导iRGC，用抗Tuj1，Brn3a和/或Pax6的抗体对ABI诱导重编程的MEF细胞进行了免疫染色。Tuj1和Brn3a或Pax6之间的双重标记显示，表达Brn3a的细胞集中在iSG中，而大多数表达Pax6的细胞分布在iSG之外（图4，B和C）。此外，所有Pax6阳性细胞共表达Brn3a，并且大多数都显示相对较弱的Brn3a表达（图4，D和F至I），表明ABI诱导MEF重编程为iRGC。与内源性RGC分布在整个RGC层中相似，Brn3a+Pax6+iRGCs分散并且没有组织成簇状的小神经节（图4，C和D），这与诱导的周围SG神经元不同。免疫反应性细胞的定量表明，所有细胞中约21.1％被ABI诱导为Brn3a+神经元，而仅约2.6％被重新编程为Pax6+细胞（图4K）。此外，共有93.1％的Tuj1+细胞共表达Brn3a，10.5％的Tuj1+细胞共表达Pax6和12.6％的Brn3a+细胞共表达Pax6（图4，L和M），表明只有一小部分的ABI重编程神经元是Brn3a+Pax6+双阳性iRGC，其中大多数是Brn3a+iSG神经元。同样，AI诱导了少量的Brn3a+Pax6+iRGC。
与ABI诱导的一小部分iRGC一致，免疫染色显示iSG以外的一些细胞对Thy1.2呈阳性（图4E）。qRT-PCR分析显示，与被GFP病毒感染的MEF相比，被ABI慢病毒感染的MEF中几种常用的RGC标记基因（包括内源性Brn3b，Brn3a，RPF-1，Pax6，Sncg，HuC和HuD）显著上调（图4J），与ABI从MEF诱导iRGCs一致。此外，在ABI重编程过程中，通过qRT-PCR分析显示从第9天开始就逐渐诱导Pax6表达。
图4下7、iSG神经元和iRGC的bulk和单细胞转录组分析
通过混合细胞普通转录组和单细胞转录组分析进一步表征了iSG神经元和iRGC。首先，在诱导2周后，对ABI和GFP转染的MEF进行了bulkRNA测序分析（图5A）。散点图和层次聚类分析表明，与GFP转导的MEF相比，在ABI转导中有许多基因的表达下调或上调，基因集富集分析（GSEA）显示这些富含与神经功能和发育相关的GOterm中上调基因显著富集，例如突触信号，突触小泡，突触组织，神经递质运输，神经递质水平的调节，胞吐作用，钙离子结合，配体门控通道活动，神经元投射，轴突和神经系统发育。这些结果与MEF的ABI诱导功能性SG和视网膜神经节神经元一致。与该方法和qRT-PCR分析方法一致（图2，W和X以及4J），bulk普通RNA-seq证实了ABI转导的MEF中许多SG和视网膜神经节基因的上调，包括NF，Brn3a，TrkB，vGlut3，Trpv1，P2X3，Gria1，Pax6，Sox11，Sncg和Thy1。
通过温和离解和过滤从MEF中分离了ABI诱导的iSG（，以及小鼠DRG、RGC单细胞悬液），然后使用10xGenomicsChromium平台对单个iSG细胞进行了scRNA-seq分析（图5A），个单细胞测序数据聚类为15个cluster/簇（图5B）。对基因表达模式的研究表明，在簇1、3、5、8和11中，一般神经元标记基因（例如Tuj1，Tau和Map2）的表达水平较高，而在其余簇中则表达较弱。相比之下，许多先前确定的MEF标记基因，包括Klf4，Mmp2和Postn，通常具有相反的表达模式，在簇1、3、5、8和11中几乎不表达，而其余簇中表达明显。拟时间轨迹产生了3个推测状态，沿着这些状态Klf4表达逐渐降低，而Tuj1，Tau和Map2的表达逐渐升高。因此，在ABI从MEF诱导2周的iSG中，仍然存在一些表达神经元和MEF标记的细胞，这表明MEF在完全重编程为成熟的iSG神经元之前经历了同时具有MEF和神经元特征的过渡中间阶段，在许多簇中，有许多细胞共同表达Tuj1和成纤维细胞标记基因波形蛋白。在ABI重编程的第6天到第12天，免疫标记检测到一些对Tuj1和波形蛋白均具有免疫反应性的细胞和神经束。
图5，上下滑动查看图片
与iSG神经元的诱导一致，NF，外周蛋白，p75NTR，TrkB，TrkC，Trpv1，Trpv2，P2X3，Accn2，Kcnq2，Cacna1a和CGRP的表达在各种iSG测序细胞簇中均存在（图5，C-K）。特别是，NF，P2X3，Accn2，Kcnq2和Cacna1a主要在簇1、3、5、8和11中表达，而外周蛋白，Trpv1和Trpv2主要存在于簇1、3中的少量细胞中，（图5，C，D，F-I和K）表示它们在成熟iSG神经元中的表达及其表达特异性。既是SG神经元又是RGC的标志物的许多基因，如Thy1，Sncg，Rbpms，Gap43，HuC，Sox11，Sox12，Zeb2，Brn3a，Brn3c和RPF-1，也在已测序的iSG细胞簇中表达（图6）。然而，RGC标记Pax6仅富集在小细胞簇12和13中，并在其他簇中的少数细胞中表达，这与观察到只有极少数iSG细胞对Pax6具有免疫反应性的观察结果一致（图4C）。簇12和13中的Pax6+细胞似乎不是iRGC，因为它们缺少RGC标记Brn3a，Brn3c和RPF-1的表达（图6I）。与iRGC分散且在iSG中很少存在的观察结果一致，只有少数细胞主要在5和6簇中共表达Pax6和Tuj1，Thy1，Gap43，HuC，Sox11，Brn3a或RPF-1。（图4C）。
图6，上下滑动查看图片
8、将HSF重编程为iSG和iRGC
仅能以低效率通过ABI慢病毒的混合物将人类皮肤成纤维细胞（HSF）重编程为iSG。为了提高重编程效率，作者创建了一个Dox诱导型慢病毒载体，该载体在由P2A和T2A自切割肽序列束缚的单个开放阅读框（ORF）中包含Ascl1，Isl1和Brn3b（图7A）。被这些表达ABI的单一病毒感染的HSF在神经分化培养基中大约45天就容易形成网络化的iSG（图7B）。这些iSG的免疫染色显示它们包含表达TUJ1，MAP2，NF，peripherin，synapsin，VGLUT1，TRKA，TRKB，TH和BRN3A的典型感觉神经元（图7，C至K）。此外，类似于MEF，ABI从HSF诱导了少量iRGC，它们对PAX6和BRN3A都具有免疫活性（图7，L和M）。qRT-PCR分析表明，从第10天开始，ABI逐渐诱导TUJ1表达，但直到第20天才诱导出更成熟的神经元标记基因MAP2（图7N）。相反，从第10天开始，成纤维细胞标记基因COL1A1和TWIST2逐渐下调（图7O）。
图7上为了确定iSG诱导是由多能还是神经祖细胞介导，通过qRT-PCR分析了ABI对HSF重编程过程中多能因子基因和神经祖标记基因的表达。在重编程过程中（从第1天到第20天）多能因子基因OCT4，KLF4和NANOG的表达水平没有显著变化（图7P）。同样，在重编程过程中也没有诱导NESTIN和OLIG2表达（图7Q），这表明iSGs是由ABI从HSFs重编程而没有多能性或神经祖细胞的中间状态。与此相一致，重编程的第30天，当将EdU添加到细胞培养物中培养29天或24小时，EdU几乎没有标记任何经过重编程的TUJ1+神经元（图7，R到X），确认iSG发生重编程时不存在增殖祖细胞的中间状态。
通过全细胞膜片钳记录来评估重编程的人iSG神经元的电生理特性。在第60天，大多数神经元（17个中的15个）表现出典型的钠和钾电流，并表现出动作电位响应（图7，Y，Z和A）。此外，内向钠电流可以被TTX特异性地完全阻断，并通过去除而部分恢复（图7A）。与小鼠iSG神经元相似，一些（17个中的4个）是多峰，而其他（17个中的11个）是单峰（图7，Y，B和C），尽管在人iSG中是单峰/单个放电，单个放电神经元似乎比小鼠iSG中的神经元更丰富（图3K）。在从第25天到第39天记录的所有神经元中，一小部分（44个中的4个）显示出自发的突触后活动（图7D），表明人iSG神经元形成功能性突触的能力与其突触素标记一致（图7F）。因此，由HSI的ABI诱导的人iSG神经元具有成熟神经元的生理特性。
图7下通过将GFP标记的人iSG神经元微注射到成年大鼠DRG外植体中，进一步研究了人iSG神经元在DRG中生存和整合的能力。移植后两周，GFP+神经元存活并整合到DRG中，并且全部（99个中的99个）被抗人核抗体免疫标记，表明在移植和受体细胞未发生物质交换。移植的GFP+细胞对泛感觉神经元标志物具有免疫反应性，其中一些对TrkA，TrkB或TrkC具有免疫反应性，这表明移植的人iSG神经元与小鼠iSG神经元相似。在DRG中存活并维持感觉神经元亚型。
小结
总之，在多个SG和RGC转录因子TF的筛选中，作者确定了三个TF组合ABI是重编程小鼠和人类成纤维细胞为自组织和网络化iSG类器官的最有效组合。通过免疫染色、qRT-PCR、全细胞膜片钳记录、钙成像以及混合bulk转录组和单细胞转录组scRNA-seq方法，能够证明iSG类器官具有分子和细胞特征、亚型多样性、电生理特性和周围神经支配能力和周围SG的特征模式。此外，使用免疫标记和scRNA-seq分析，鉴定出了真正的RGC特异性分子标记，以证明ABI组合具有从成纤维细胞诱导少量iRGC的额外能力。不同于内源性SG的ABI重编程的iSG类动物器官，iRGC保持类似于视网膜中内源性RGC的分散分布模式。重编程的iSG类器官和iRGC为研究SG发育和感觉疾病发病机理以及产生用于患者特异性细胞替代治疗的细胞、药物筛选和体外疾病建模提供了强有力的策略
文献下载：
链接:
